43. THIẾT LẬP BỘ MẪU CHUẨN SỬ DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG TẢI LƯỢNG VIRUS DENGUE Ở NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT
Main Article Content
Abstract
Mục tiêu: Thiết lập bộ mẫu chuẩn sử dụng trong định lượng virus Dengue bằng kỹ thuật RT-PCR và đánh giá hiệu quả của bộ mẫu chuẩn trong định lượng virus Dengue trên các mẫu lâm sàng.
Đối tượng và phương pháp: Trình tự gen của 4 serotype Dengue trên thế giới và Việt Nam sử dụng lựa chọn vùng gen đích cho mẫu chuẩn và thiết kế mồi, probe cho RT-PCR. Tổng số 250 người bệnh nghi nhiễm sốt xuất huyết được thu thập tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2022-2023. Mẫu huyết tương được thu thập và tách chiết RNA sử dụng cho xác định tải lượng virus Dengue sử dụng bộ mẫu chuẩn nội bộ. Quy trình xây dựng bộ chuẩn DNA plasmid của virus Dengue được thiết kế bao gồm các bước như sau: (1) Phân lập vùng gen đích của virus Dengue, (2) Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa vùng gen đích của virus Dengue, (3) Thiết lập bộ mẫu chuẩn DNA plasmid chứa vùng gen đích virus Dengue, và (4) Đánh giá bộ mẫu chuẩn bằng kỹ thuật RT-qPCR.
Kết quả: Bộ mẫu chuẩn DNA plasmid chứa vùng gen 3’UTR đặc hiệu với virus Dengue có phạm vi tuyến tính nằm trong khoảng 103-1010 copies/mL với hiệu suất của phản ứng E = 99%, độ dốc là -3,348, hệ số tương quan R2 = 0,99912 và LOD = 522 bản sao/ml với độ tin cậy 95%, độ ổn định trong 6 tháng với hệ số biến thiên lần lượt là 1,36%; 1,07% và 1,23%. Tải lượng virus Dengue trung bình ở nhóm dương tính với NS1 là 5,93 ± 1,80 log₁₀ copies/ml cao hơn so với nhóm NS1 âm tính là 4,19 ± 0,77 log₁₀ copies/ml (p < 0,001). Tải lượng virus Dengue trung bình ở người bệnh trong 3 ngày đầu của bệnh đạt (7,60 ± 1,22) log₁₀ copies/ml, cao hơn so với tải lượng ghi nhận trên người bệnh có số ngày của bệnh từ 3-5 ngày (5,43 ± 1,68) log₁₀ copies/ml và từ ngày thứ 5 trở đi (4,84 ± 0,92) log₁₀ copies/ml (p < 0,001).
Kết luận: Thiết lập thành công bộ mẫu chuẩn nội bộ định lượng virus Dengue trên vùng gen 3’UTR làm tiền đề cho phát triển và kiểm định kit chẩn đoán axit nucleic của virus Dengue ở Việt Nam.
Article Details
Keywords
Bộ mẫu chuẩn, RT-qPCR, định lượng, virus Dengue.
References
[2] Nanaware N, Banerjee A et al. Dengue virus infection: A tale of viral exploitations and host responses. Viruses, 2021, 13 (10), 1967.
[3] Sinha S, Singh K et al. Dengue virus pathogenesis and host molecular machineries. J Biomed Sci, 2024, 31, 43.
[4] Murugesan A, Manoharan M. Dengue virus. Emerging and reemerging viral pathogens, 2019, 281.
[5] Cục Quân y. Toàn quân đã kiểm soát tốt dịch sốt xuất huyết Dengue. https://www.qdnd.vn,
[6] Wang S.M, Sekaran S.D. Evaluation of a commercial SD Dengue virus NS1 antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay kit for early diagnosis of Dengue virus infection. J Clin Microbiol, 2010, 48 (8), 2793-2797.
[7] Dayarathna S, Kuruppu H, Silva T et al. Are viral loads in the febrile phase a predictive factor of Dengue disease severity? BMC Infect Dis, 2024, 24 (1), 1248.
[8] Lanciotti R.S, Calisher C.H, Gubler D.J et al. Rapid detection and typing of Dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1992, 30 (3), 545-551.
[9] Bunk D.M. Reference materials and reference measurement procedures: An overview from a National Metrology Institute. Clin Biochem Rev, 2007, 28 (4), 131-137.
[10] Madej R.M, Davis J, Holden M.J et al. International standards and reference materials for quantitative molecular infectious disease testing. J Mol Diagn, 2010, 12 (2), 133-143.
[11] Barker P.E, Watson M.S, Ticehurst J.R et al. NIST physical standards for DNA-based medical testing. J Clin Lab Anal, 2002, 16 (1), 5-10.
[12] Leparc-Goffart I, Baragatti M, Temmam S et al. Development and validation of real-time one-step reverse transcription-PCR for the detection and typing of Dengue viruses. J Clin Virol, 2009, 45 (1), 61-66.
[13] Hue K.D.T, Tuan T.V, Thi H.T.N et al. Validation of an internally controlled one-step real-time multiplex RT-PCR assay for the detection and quantitation of Dengue virus RNA in plasma. J Virol Methods, 2011, 177 (2), 168-173.
[14] Pongsiri P, Praianantathavorn K, Theamboonlers A et al. Multiplex real-time RT-PCR for detecting chikungunya virus and Dengue virus. Asian Pac J Trop Med, 2012, 5 (5), 342-346.
[15] Kinanti D.R, Ahmad I, Putra R et al. Evaluation of in-house Dengue real-time PCR assays in West Java, Indonesia. PeerJ, 2024, 12, e17758.
[16] De La Cruz Hernández S.I, Flores-Aguilar H, González-Mateos S et al. Viral load in patients infected with Dengue is modulated by the presence of anti-Dengue IgM antibodies. J Clin Virol, 2013, 58 (1), 258-261.
[17] Pillay K, Keddie S.H, Fitchett E et al. Evaluating the performance of common reference laboratory tests for acute Dengue diagnosis: a systematic review and meta-analysis of RT-PCR, NS1 ELISA, and IgM ELISA. The Lancet Microbe, 2025, 6 (7), 101088.
[18] de Oliveira C.M, Takahashi F.Y, Silva R.S et al. Evaluation of the performance of a dengue NS1 assay during the 2024 epidemic in Brazil. Journal of Virological Methods, 2025, 335, 115143.