Bài báo khoa học Tập 66 Số CĐ1-NCKH 24/01/2025

24. PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH ĐẠI TRUNG GIAN VÒNG LẶP CHO PHÁT HIỆN VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN

Trần Hồng Diễm1,2, Nguyễn Thị Trúc Anh3,4, Nguyễn Hồng Phúc1, Vũ Quang Hiếu5,6
1 Viện Kỹ thuật công nghệ cao NTT, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
2 NTT Hitech Institute, Nguyen Tat Thanh University
3 University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh city
4 Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh
5 Department of Biotechnology, NTT Hitech Institute, Nguyen Tat Thanh University
6 Khoa Công nghệ sinh học, Viện Kỹ thuật công cghệ cao NTT, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
Tác giả liên hệ: vqhieu@ntt.edu.vn
DOI: 10.52163/yhc.v66iCD1.1989
87 Lượt xem
83 Lượt tải xuống
Từ khóa
LAMP MRSA mẫu phết mũi khuếch đại đẳng nhiệt gene mecA
Tóm tắt

Mục tiêu: Phát triển phương pháp khuếch đại trung gian vòng lặp (LAMP) trong phát hiện vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin bằng gene mecA đặc trưng ứng dụng trong phát hiện nhanh MRSA trên mẫu phết mũi.

Phương pháp: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành 60 mẫu phết mũi ở nhóm người khỏe mạnh có độ tuổi từ 18-25. Thực hiện thiết kế bộ mồi đặc hiệu cho phản ứng LAMP trên phần mềm thiết kế mồi. Phản ứng LAMP được tối ưu hóa điều kiện phản ứng trong phòng thí nghiệm nhằm xác định nhiệt độ, độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện tối thiểu của DNA (LOD). Phản ứng LAMP sau tối ưu được thử nghiệm trên 60 mẫu ly trích DNA từ mẫu phết mũi, trong đó có 30 mẫu dương tính với MRSA và 30 mẫu âm tính với MRSA.

Kết quả: Các cặp mồi đặc hiệu cho gene mecA đã được thiết kế và phản ứng khuếch đại được tối ưu hóa ở 65°C trong 30 phút. Phương pháp LAMP cho kết quả nhạy, đặc hiệu cao với giới hạn phát hiện thấp nhất (LOD) là 1 pg DNA tách chiết từ MRSA có trong mỗi phản ứng và không xảy ra phản ứng chéo loài. Khi ứng dụng phương pháp LAMP trên 60 mẫu DNA tách chiết từ mẫu phết mũi, phản ứng LAMP đã cho độ nhạy, độ đặc hiệu đạt 100% và hệ số Kappa bằng 1 đạt mức tương đồng cao khi so sánh với phương pháp nuôi cấy vi sinh và PCR truyền thống.

Kết luận: Nghiên cứu đã ứng dụng phương pháp LAMP trong phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn MRSA từ các mẫu lâm sàng, với độ đặc hiệu, độ nhạy cao bằng gene mecA. Đồng thời, nghiên cứu cũng cho thấy mức độ tương đồng cao giữa phương pháp LAMP và phương pháp chẩn đoán nuôi cấy vi sinh và PCR. LAMP là một phương pháp đầy tiềm năng để phát hiện MRSA, là công cụ chẩn đoán nhanh có tính ứng dụng cao, hỗ trợ điều trị hiệu quả.

Tài liệu tham khảo
[1]
Tong S.Y.C, Davis J.S, Eichenberger E et al, Staphylococcus aureus infections: Epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management, Clin Microbiol Rev, 28, Epub ahead of print 2015, doi: 10.1128/CMR.00134-14. Google Scholar
[2]
Adams C.E, Dancer S.J, Dynamic transmission of Staphylococcus aureus in the intensive care unit, International Journal of Environmental Research and Public Health, 17, Epub ahead of print 2020, doi: 10.3390/ijerph17062109. Google Scholar
[3]
Howden B.P, Giulieri S.G, Wong Fok Lung T et al, Staphylococcus aureus host interactions and adaptation, Nature Reviews Microbiology, 21, Epub ahead of print 2023, doi: 10.1038/s41579-023-00852-y. Google Scholar
[4]
David M.Z.S, Treatment of Staphylococcus aureus, Assess Eval High Educ, 2012, 37: 435. Google Scholar
[5]
David M.Z, Daum R.S, Treatment of Staphylococcus aureus Infections, In: Bagnoli F, Rappuoli R, Grandi G (eds) Staphylococcus aureus: Microbiology, Pathology, Immunology, Therapy and Prophylaxis. Cham: Springer International Publishing, 2017, pp. 325-383. Google Scholar
[6]
Kadariya J, Smith T.C, Thapaliya D, Staphylococcus aureus and Staphylococcal Food-Borne Disease: An Ongoing Challenge in Public Health, Biomed Res Int 2014, 2014: 827965. Google Scholar
[7]
Lam J.C, Stokes W, The Golden Grapes of Wrath - Staphylococcus aureus Bacteremia: A Clinical Review, American Journal of Medicine, 136, Epub ahead of print 2023, doi: 10.1016/j.amjmed.2022.09.017. Google Scholar
[8]
Misra N, Pu X, Holt D.N et al, Immunoproteomics to identify Staphylococcus aureus antigens expressed in bovine milk during mastitis, J Dairy Sci 2018, 101: 6296-6309. Google Scholar
[9]
Lee A.S, De Lencastre H, Garau J et al, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Nat Rev Dis Primers 2018, 4: 1-23. Google Scholar
[10]
Cheung G.Y.C, Bae J.S, Otto M, Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus, Virulence, 12, Epub ahead of print 2021, doi: 10.1080/21505594.2021.1878688. Google Scholar
[11]
Huletsky A, Giroux R, Rossbach V et al, New Real-Time PCR Assay for Rapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Directly from Specimens Containing a Mixture of Staphylococci, J Clin Microbiol, 2004, 42: 1875-1884. Google Scholar
[12]
Luteijn J.M, Hubben G.A.A, Pechlivanoglou P et al, Diagnostic accuracy of culture-based and PCR-based detection tests for methicillin-resistant Staphylococcus aureus: A meta-analysis, Clinical Microbiology and Infection, 2011, 17: 146-154. Google Scholar
[13]
Okolie C.E, Wooldridge K.G, Turner D.P.J.J et al, Development of a heptaplex PCR assay for identification of Staphylococcus aureus and CoNS with simultaneous detection of virulence and antibiotic resistance genes, BMC Microbiol, 2015, 15: 157. Google Scholar
[14]
Milheiriço C, Oliveira D.C, De Lencastre H, Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus, Antimicrob Agents Chemother, Epub ahead of print, 2007, doi: 10.1128/AAC.00275-07. Google Scholar
[15]
DeLeo F.R, Otto M, Kreiswirth B.N et al, Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus, The Lancet, 2010, 375: 1557-1568. Google Scholar
[16]
Sheet O.H, Grabowski N.T, Klein G et al, Development and validation of a loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of Staphylococcus aureus in bovine mastitis milk samples, Mol Cell Probes, 2016, 30: 320-325. Google Scholar
[17]
Ou A, Wang K, Mao Y et al, First Report on the Rapid Detection and Identification of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Viable but Non-culturable (VBNC) Under Food Storage Conditions, Front Microbiol, 2021, 11: 1-7. Google Scholar
[18]
Liu W, Dong D, Yang Z et al, Polymerase Spiral Reaction (PSR): A novel isothermal nucleic acid amplification method, Sci Rep, 2015, 5: 12723. Google Scholar
[19]
Geng Y, Liu S, Wang J et al, Rapid Detection of Staphylococcus aureus in Food Using a Recombinase Polymerase Amplification-Based Assay, Food Anal Methods, 2018, 11: 2847-2856. Google Scholar
[20]
Tran D.H, Tran H.T, Le U.P et al, Direct colorimetric LAMP assay for rapid detection of African swine fever virus: A validation study during an outbreak in Vietnam, Transbound Emerg Dis, 2021, 68: 2595-2602. Google Scholar
[21]
Abdullah J, Saffie N, Sjasri F.A.R et al, Rapid detection of Salmonella typhi by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method, Brazilian Journal of Microbiology, 2014, 45: 1385-1391. Google Scholar
[22]
Torigoe H, Seki M, Yamashita Y et al, Detection of Haemophilus influenzae by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of the outer membrane protein P6 gene, Jpn J Infect Dis, 2007, 60: 55-58. Google Scholar
[23]
Kim H.J, Kim YJ, Yong D.E et al, Loop-mediated isothermal amplification of vanA gene enables a rapid and naked-eye detection of vancomycin-resistant enterococci infection, J Microbiol Methods, 2014, 104: 61-66. Google Scholar
[24]
Tang C.T, Nguyen D.T, Hoa N.T et al, An outbreak of severe infections with community-acquired MRSA carrying the panton-valentine leukocidin following vaccination, PLoS One, 2, Epub ahead of print, 2007, doi: 10.1371/journal.pone.0000822. Google Scholar
[25]
Otto M, Community-associated MRSA: What makes them special? International Journal of Medical Microbiology, Epub ahead of print, 2013, doi: 10.1016/j.ijmm.2013.02.007. Google Scholar
[26]
Notomi T, Okayama H, Masubuchi H et al, Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Res, 2000, 28: e63-e63. Google Scholar
[27]
Abusheraida N.S.A, AlBaker A.A.H, Aljabri A.S.A et al, Rapid Visual Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Human Clinical Samples via Closed LAMP Assay Targeting mecA and spa Genes, Microorganisms, 12, Epub ahead of print 2024, doi: 10.3390/microorganisms12010157. Google Scholar
[28]
Emara M.M.M, Ghoname N.F, Ramadan M.O et al, Evaluation of loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus in Tanta University Hospitals in Egypt, Microbes and Infectious Diseases, 2023, 4: 1219-1231. Google Scholar